【小翊实验手帐】细胞活力检测，谁才是王者

每次做MTT实验，结果一次一个样，实验重复性那么差，这样的实验数据怎么能发表……
看到纠结的童鞋，小翊也是深有同感，数据不准确，文章很头疼，怎么办？
不用担心，师兄最近刚安利了一款新型的细胞增殖和活性检测试剂CCK-8，可以完全解决实验重复性差的问题。
现在让小翊来评测对比下CCK-8和MTT，谁才是王者~

原理PK
CCK-8：是WST-8在电子耦合载体1-Methoxy PMS存在的情况下被线粒体内的脱氢酶还原成水溶性的橙黄色甲臜产物（formazan）。通过酶标仪测量细胞液的OD值便可检测出待测细胞样品的活性。

CCK-8细胞活性检测原理图

MTT: 是利用活细胞的线粒体脱氢酶在代谢过程中将黄色的可溶性四唑盐MTT还原为不溶于水的蓝紫色产物-甲臜(Formazan)晶体。使用合适的溶解液如DM SO溶解沉积在细胞中的甲臜晶体，通过酶标仪测量细胞液的OD值便可检测出待测细胞样品的活性。

MTT胞活性检测原理图

操作流程PK：

CCK-8和MTT操作流程图

使用MTT法进行活力检测时，生成的甲臜产物需要用DMSO溶解，颗粒不完全溶解或者在吸取上清操作过程中带走部分细胞等情况，往往会导致实验结果稳定性查、重复性差等一系列问题，有的期刊可能质疑数据的正确性。
CCK-8生成的甲臜产物是水溶性的，可直接测定OD值，不存在不完全溶解和产物被带走的情况，可以完全避免MTT法在操作上带来的误差。

下面分享几点小翊师兄进行CCK8细胞活力检测的经验。
1.起始细胞接种数量：以使用标准96孔板为例，贴壁细胞的最小接种量至少为1,000 个/孔 (100 μL 培养基)。如果检测白细胞，灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2,500 个/孔 (100 μL 培养基)。
2 .CCK-8加入剂量：一般建议为按培养体系的10%添加，添加过程中应避免产生气泡。
3 .细胞孵育时间：孵育时间一般为1-4小时，一般悬浮细胞孵育的时间要长于贴壁细胞，由于CCK-8的OD值处在1.0左右是比较好的检测结果，建议实验者可以每隔0.5h测定一次OD值，以摸索出最佳孵育时间。
4 .检测波长：如果没有450 nm的滤光片，可以使用吸光度在430-490 nm之间的滤光片，但是450 nm滤光片的检测灵敏度最高。
5 .CCK-8对细胞的毒性：CCK-8毒性非常低，检测完后相同的细胞可以继续进行其它细胞增殖检测，如结晶紫染色法、中性红染色法或DNA荧光染色法等。

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